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前言

使用拉曼光谱技术追踪载体蛋白质的运动，指的是利用拉曼光谱技术来监测和分析载体蛋白质的运动或动态变化。

拉曼光谱是一种应用于分析化学和分子物理学的技术，用于研究分子的振动、旋转和其他低频模式。它通过照射激光到样品上并测量散射光来实现。所得到的拉曼光谱提供了关于样品的分子结构和组成的信息。

在"追踪载体蛋白质的运动"的背景下，该技术被应用于监测载体蛋白质的动态变化。载体蛋白质是一类参与将分子跨越细胞膜或在血液中运输的蛋白质。它们通过构象变化和运动来完成其功能。

通过使用拉曼光谱技术，研究人员可以实时分析载体蛋白质内部的振动和结构变化。这可以提供关于其功能机制、与其他分子的相互作用以及环境因素对其行为的影响的洞察。

通过追踪这些蛋白质的运动，科学家们可以更好地了解载体蛋白质的工作原理，并可能开发出操控或调节其功能的策略，用于各种应用，如药物传递或疾病治疗。

一、实验目的

进行这个实验是为了解决微生物和组合式生物合成的可行性，这可以开发出更高效的合成药物类分子，其成功取决于了解合成酶内部蛋白质之间的对接方式。

尽管当前的混合匹配方法经常因载体蛋白（CP）与其他酶之间的不兼容性而失败，但失败的原因尚不完全清楚。

CP是动态蛋白质，对于重要的药物类分子如脂肪酸、聚酮和非核糖体肽等的生物合成起着最核心的作用。

这些小蛋白质与几乎所有其他合成酶内部的蛋白质相互作用，并在天然产物的生物合成过程中通过连接各种分子构建单元和中间体。

1.1合成酶中载体蛋白质（CP）的构象变化

虽然可视化CP的构象变化和与其他物种的相互作用，对于创建功能性的混合合成酶至关重要，但直接捕获瞬时相互作用和CP构象分布的全部集合仍然存在挑战，原因至少有两个。

首先，与催化相关的CP运动被认为发生在微秒到皮秒（μs到ps）的时间尺度上，因此核磁共振光谱（NMR）和X射线晶体学都不能直接揭示CP在催化过程中构象分布的情况。

其次，这些传统的蛋白质结构方法需要耗费大量时间、资源和样品。

CP的构象移动和重要特征是18 Å的4'-磷酸泛酰乙酰胺（Ppant）臂，它通常通过转录后修饰连接到CP螺旋II的保守丝氨酸残基上。

Ppant臂以硫酯的形式共价地连接了所有构建单元和中间体，并且其柔性使得CP能够将特定的分子载体固定在其疏水腔中。

这种链固定被认为可以保护生长代谢物免受与胞质组分的非期望化学反应，并且推动其他整体构象变化，从而增强CP对特定酶的特异性。

在以迭代方式起作用的离散酶的II型系统中，链固定主要观察到，其中在生物合成的程序阶段，中间体的保护和运输对于保持化学准确性至关重要。相比之下，具有共价连接的催化域的模块化I型合成酶通常不表现出底物固定。

链固定的精确分子基础尚不清楚，但被认为涉及至少三个因素的相互作用：CP序列、底物长度和底物极性。

1.2位点特异性振动光谱对物质可视化的方式

在这里我们发现了一种更加简单、低成本的方法，通过位点特异性振动光谱来可视化CP-底物相互作用的全部集合。

简单来说，就是通过使用可商业获得的含炔基探针的分子底物模拟物，通过配体酶催化将羧酸与Ppant臂上的端硫醇发生加成反应，将其连接到CP上。然后使用炔基C≡C伸缩带来报告探针环境的变化，可以在皮秒时间分辨率下区分非固定的水溶态（较低频率）和固定的疏水环境（较高频率）。

将原生底物修饰为包含端炔基预计对自然系统的影响只有最小的扰动，因为它不改变分子载体的总长度、体积或疏水性。炔基C≡C伸缩带是拉曼光谱透明区域中（接近2100 cm−1）强、窄且独特的信号，不会与未标记的CP或其他蛋白质的溶剂或生物分子信号重叠。

对于上图中的实验报告，我们用了拉曼光谱确定CP-底物相互作用的工作流程。通过具有选择长度的炔基标记脂肪酸（顶部）经瞬时酶AasS催化连接到Ppant臂的末端巯基上。标记的分子载体用于报告底物是否被固定在CP的疏水腔中，通过拉曼散射光谱的变化。C≡C频率报告溶剂化环境（当探针位于水环境中时，频率较低；当探针位于蛋白质的疏水腔中时，频率较高），线形报告皮秒分辨率的构象范围。

二、实验结果链序列化行为的表现结果

2.1实验对象三种酰载体蛋白

为了进行概念验证实验，我们收集了三种酰载体蛋白（ACP）的数据，其中关于链序列化信息已经通过NMR和分子动力学（MD）模拟进行了报道：大肠杆菌II型脂肪酸合酶（FAS；EcACP），链霉菌II型抗红素聚酮合酶（PKS，Act ACP）和哺乳动物大鼠I型FAS（Rat ACP）。

对于EcACP，MD模拟表明辛酰酰链是完全序列化ACP疏水核心内分子货物的理想长度13。较短的酰链被认为非常活动且较少序列化，因为ACP腔室太大无法稳定短底物；较大的酰链仅在链的末端被序列化14。

以前对Rat ACP在各种酰化状态下进行的NMR分析表明，由于内部口袋中有体积大的疏水残基，Rat ACP不会序列化任何疏水酰基中间体11。

Rat ACP应被视为具有受抑制的序列化能力的EcACP的类似物，因为已经证明Rat ACP至少可以部分替代EcACP在体外与大肠杆菌FAS的酰转移酶、酮合酶和还原酶结构域发生功能性相互作用15。

综合考虑EcACP和Rat ACP系统，这些结果为初步实验提供了理想的对比。Act ACP的NMR研究显示了有趣且明显的行为：丁酰酰、己酰酰和辛酰酰链在疏水腔室内结合，但底物位于其传统取向的垂直位置，可能是由于腔室尺寸较大。

2.2成功验证拉曼探针的可视化

我们先让带有His标签的ACP实验对象，从大肠杆菌BAP1中接入事先准备好的感受态细胞16中进行表达和纯化。

如有必要，我们会使用来自枯草杆菌（B. subtilis）的R4-4 Sfp转移酶（Sfp）完全磷酸盐泛酰乙胺修饰ACP17。

使用哈维维异养细菌酰-ACP合酶（AasS）对含炔烃基的羧酸进行酰化，将其连接到Ppant臂的末端硫醇上18。

在EcACP和Rat ACP上加载7-辛炔酸（模拟八碳C8底物）产生了不同的拉曼光谱，位于炔基探针信号区域。

根据文献我们查询到的资料，预期EcACP会序列化C8货物，其频率比缓冲水溶液中的C8探针更高，与序列化一致。相反，Rat ACP探针的频率和线形几乎与溶解的探针相同，表明Rat ACP上的相同链未被序列化。

装载7-辛炔酸的Act ACP的探针拉曼光谱更加宽广，涵盖与疏水和水性环境相关的频率，与NMR数据中对辛酰酰Act ACP的建议一致，即C8底物只部分序列化19。综合来看，这些已经被表征的ACP的结果验证了我们基于拉曼探针的方法可视化CP链序列化的可行性。

上图中中的光谱凸显了C≡C频率报告序列化：线形直接报告了探针所经历的环境的完整分布，因此提供了关于底物序列化的异质性性质的直接信息，具有足够的时间分辨率。对于这种振动探针，拉曼光谱的固有时间尺度约为10 ps，任何较慢相互转换的构型都可以在光谱线形中区分出来。

三、实验结果

在接下来的实验中，我们使用这种技术直接评估了酰链长度在链序列化中的作用。选择了大肠杆菌II型脂肪酸合酶（FAS；EcACP）作为研究对象，并使用4-戊炔酸（C5底物）和12-十三炔酸（C13底物）对其进行酰化。

通过晶体学和NMR研究，已经确定己酰、庚酰和癸酰链被完全序列化，但丁酰链在底物环境中的具体范围尚不清楚。

通过对EcACP上C5和C13探针的拉曼光谱进行分析，发现C5探针未被序列化，而C13探针显示出与序列化的C8探针相似的光谱。这表明较长的探针标记链被序列化，这为我们了解EcACP与较长链长度（如C13）的相互作用提供了新的见解。

这些实验结果提示了基于拉曼的技术在研究整个底物延长过程中底物序列化如何变化的潜力，而这在以前的工作中尚未得到研究。

该方法具有快速、低成本、高效的特点，可以用于分析载体蛋白（CP）与底物之间的相互作用，而无需进行复杂的蛋白质结构渲染。所有步骤都适用于高通量方法，从而可以快速对常规结构数据不可用的CP进行表征。

为了进一步研究这些CP中的链序列化，我们将C8-炔基探针连接到两种以前未经表征的II型PKS ACPs（arimetamycin（Arm ACP）和benastatin（Ben ACP））以及孢子色素生物合成基因簇中的ACP（WhiE ACP）上。

实验结果显示，Arm ACP的光谱显示出比缓冲溶液中的C8探针更高的C≡C频率，而Ben ACP和WhiE ACP的光谱与水性C8探针几乎相同。WhiE ACP上装载C5探针的光谱表明其处于非序列化状态。

四、结论

综合Act ACP上C8探针的数据，这些结果支持II型PKS ACPs的一般特征假设，即它们的疏水腔室过大，无法相对于原生底物完全稳定较短和/或极性较低的酰链探针。

通过将所描述的拉曼探针技术与合成更复杂的底物中间体和/或标记的ACP的位点定向突变相结合，发现了更多关于ACP和其他生物合成途径中的CP中链序列化的确切分子相互作用的细节。这些发现和研究可以为以后的相似研究的突破方向提供具体的数据和应用基础。

参考文献：

1. McDaniel, R. et al.在1999年的《美国国家科学院院刊》中发表的文章（对红霉素多酮合酶进行了多个基因修饰，以产生一系列新颖的“非自然”天然产物。）
2. Chan,Vogel,在2010年发表在《生物化学杂志》中的（对脂肪酸合成和酰载体蛋白（ACP）的理解）
3. Kovermann、Rogne和Wolf-Watz等人于2016年发表的文章《蛋白质动力学与功能的溶液态NMR谱学》